Práctica 25. Tinción de Gram

CARACTERÍSTICAS:

• Tinción diferencial empleada en microbiología para la visualización de bacterias.
• Se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram +  y Gram -.
• La pared celular de las bacterias Gram + posee una gruesa capa de peptidoglicano.
• Las Gram - tienen una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior de lipoproteínas.

MATERIALES QUE SE NECESITAN:

• Portaobjetos.
• Cristalizador o fregadero y paralelas.
• Pinzas.
• Asa de platino.
• Mechero Bunsen.
• Microscopio.
• Aceite de inmersión.
• Reactivos: Violeta de Genciana, Fuchsina básica diluida, solución de lugol y alcohol de 96º.

TÉCNICA:

• Extensión de la muestra en el portaobjetos.

• Desecación a Tª ambiente o con la ayuda de la llama del mechero teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo.

• Fijación con calor, cortando la llama con la preparación.
• Para que las células se adhieran al portaobjetos.
• El calor desnaturaliza las proteínas y suele matar el microorganismo.
• Tinción con violeta: 1 minuto.
• Colorante básico, que se aplica sobre la muestra y reacciona con las células, coloreándolas.
• Todas las células se tiñen de color azul-violeta.

• Sin lavar, reemplazar el colorante por solución de lugol, arrastrándolo primero y dejándolo actuar 1 minuto.
• Mordiente que incrementa la afinidad entre el colorante y la célula.
• Formando un compuesto insoluble en el interior de la misma.

• Lavar con agua.

• Decolorar con alcohol durante aprox 30 segundos hasta lograr que la preparación salga exenta de colorante (paso crítico).
• Los Gram + no se decoloran, mientras que los Gram - si.

• Lavar con agua.
• Tinción con fuchsina: 3 minutos.
• Colorante de contraste, de carácter básico.
• Dejará un color rosado únicamente en las bacterias Gram -.
• Lavar con agua.
• Secar al aire libre o con la ayuda de la llama del mechero.

• Observar al microscopio óptico: es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmserión
• Colocar la preparación sobre la platina.
• Enfocar con los distintos aumentos.

• Conectar el sistema de iluminación y colocar el objetivo necesario para la observación (100x).
• Con el tornillo macrométrico aproximar el objetivo pero sin tocar la preparación.
• Cuando se usa el objetivo de inmersión (100x).
• Se coloca el condensador en la parte más alta.
• Se añade una gota de aceite sobre la preparación.
• Se baja el objetivo con cuidado hasta tocar el aceite.
• Enfocar mirando a través del ocular.
• Terminar de enfocar ajustando con el micrométrico.

CONCLUSIONES:

• Es una tinción diferencial que emplea secuencialmente 2 colorantes para distinguir 2 tipos de microorganismos en función de sus diferencias en la pared celular.
• La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere rigidez a la pared celular bacteriana.
• Las Gram + lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram -.
• La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram - es soluble en solventes orgánicos.
• Las bacterias Gram + se ven de color azul-violeta, mientras que las Gram - se ven de color rosado.
• Método de gran utilidad pero debe ser valorado con precaución:
• La reacción puede variar según la edad de las células: cultivos viejos de bacterias Gram + pueden perder capas de peptidoglicano y teñirse como Gram - .
• Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo de que bacterias Gram + se tiñan como Gram -.